一、输入序列，选择数据库，设置参数后提交任务。

1. 在“服务首页”页面，如下所示的框内输入要查询的 DNA 序列。

每行粘贴 1 对引物的信息，包含以空白字符（如水平制表符 Tab）分隔的 3 列，第 1 列为引物编号，第 2 列为上游引物序列，第 3 列为下游引物序列。单条引物序列长度可修改，当前服务器设置为 ≥ 10 bp 且 ≤ 40 bp。

2. 选择要 blast 的数据库。

图中物种选择了小麦 IWGSC RefSeq v2.0 参考基因组的 5 同源群染色体，那么任务提交后会将序列和这 3 条染色体序列分别进行比对。至于其他参数（“BLASTN 算法参数”），可以根据需要设定，这里直接用默认的。其中，perc_identity 和 qcov_hsp_perc 越大，对匹配序列和查询序列的相似度要求越高。evalue（要大于 0）越小，对相似度的要求越高。这些参数都是 blastn 程序的，点击图中链接会访问 NCBI 的相关用户手册。

3. 提交任务。

设定妥当，点击 BLASTN 按钮，提交任务。

点击后将跳转至“任务状态”页面。

页面会自动刷新，直至任务完成。图中给出了一个“任务编号”，也就是 t61010fcf，你可以记录下它，稍后访问 任务状态，根据这个 Id 来查询并操作。

某些物种（例如小麦）基因组很大，若服务器配置较低，blastn 就可能得跑比较久。之所以限定最多允许一次检索 30 条序列，也是怕服务器伤不起。

二、根据 blast 结果进行分析。

1. Blastn 结束后任务状态页面 + 选项卡 + 查看 Blast 结果。

Blastn 结束后，页面会如下图所示。

上图的顶部给出了任务编号、比对的引物对数和参考基因组，以及当前服务器对临时任务的保留时长：7 日。

上图的中部为“操控台”，修改参数后“错误和警告信息”和图底部结果选项卡可以即时响应。“操控台”中，“引物编号”可多选，“染色体”只能单选，pident、qcovhsp 和“最大可接受物理定位间距”请勿输入负数。

“错误和警告信息”模块将显示错误（字体为红色）和警告（字体为黑色）。

上图的底部有 4 个选项卡，分别为“Blast 结果”“定位结果”“定位图”和“附表”。鼠标左键单击相应选项卡，可看到相应的结果、图表。

页面刚刷新出来时，会展示“Blast 结果”，其中“Forward primer”下面的文本框内展示上游引物的 blast 结果，“Reverse primer”下的文本框则展示下游引物的 blast 结果，若有需要，可以选中后复制保存至文档。

2. 查看定位结果。

如上面 3 张图所示，点击“定位结果”选项卡，再分别点击“染色体”列表中的 3 条染色体，观察可知 2 对引物均是在 5B 上有较好的定位，可能扩增出长度合适（1,000 bp 及以下）的产物。5A 和 5D 则无法很好的定位，可能扩增不出长度合适的产物，相应的，根据“错误和警告信息”指示，此时，虽然展示了“定位成功”的结果，但是上下游引物定位距离过远，因此显示为黑灰色，即虽有定位，但可能不合适。

若存在引物对只有一条序列可以定位，或两条序列均无法定位，将展示“定位失败”的引物编号表。

单击“定位成功”，可以对表格内容进行全选，方便复制。

若勾选“显示所有可接受的定位结果（不勾选则展示间隔最小的定位结果）”，则“错误和警告信息”显示“未发现可接受的定位结果”。此复选框主要针对随机引物，其可能在同一染色体上有多处扩增，勾选则全部展示，否则只展示间距最小的定位结果。

若“定位成功”，且上下游引物定位间距在限定范围内，则可以单击相应“Id”（下图红色箭头指示），查看定位区间的序列。

3. 查看定位图。

如上图所示，点击“定位图”选项卡，可绘制出 2 对引物的定位图，可对图片进行保存，鼠标悬浮在定位图中的分子标记编号、物理位置和枝杈上时，将展示出其具体的定位坐标和上下游引物定位间距。同时，在图片右侧给出了染色体的长度和定位表，点击“物理定位数据”可以全选相应表格内容，方便复制。

可将“定位图”展示的染色体长度和物理定位数据保存汇总，而后在“绘图”页面进行进一步作图。

4. 查看附表。

如上图，点击“附表”选项卡，可查看任务的相关参数。

本服务提供了一个专门的绘图页面，方便：（1）对由本服务产生的多组数据汇总画图，（2）对从其他地方获取的数据进行绘图。

如下图所示，该页面包括 3 大块：

1. 参数设定选项卡集合。
2. 错误和警告信息。
3. 绘图结果。

1. “染色体”选项卡。

如上图，用户需要填写 2 块内容：

1. 染色体名称及长度：文本框中给出了数据格式说明，即“#”号开头的前几行。用户可以填入自己的数据，或者直接点选下拉列表来直接从服务器数据库获取数据。注意，此处文本框中的染色体名称需要和“画到一个组的染色体”“物理定位”“参考分布”中的染色体名称保持一致。
2. 画到一个组的染色体：需要填入一个或多个染色体名称，只支持一组染色体，即画图的时候画在一行上。上图为点击“Example”链接使用了示例数据。

2. “物理定位”选项卡。

用户需要提供至少 3 列数据：编号（Id）、染色体（Chromosome）和物理定位坐标（Position），并指明对应的列数。上图为点击“Example”链接使用了示例数据。注意，“染色体名称”需要与其他地方填入的数据保持一致。

Color 列为可选，可填入合适的 HTML 颜色名；Color 所在列设为 0 时，将直接使用默认颜色。

3. “参考分布”选项卡。

该选项卡内容为可选，主要是为了方便在图中指示着丝粒大致位置。

用户需要提供 3 列数据：染色体名称、位置坐标和丰度。其中，“位置坐标”列为区段坐标，例如为 1 Mb、500 Kb、100 Kb 等，可以设定其单位；“丰度”列则表示在相应区段内参考序列的丰度，例如着丝粒特异探针序列在 1 Mb 区段的同源拷贝数。

上图使用了“Example - wheat Oliogo-CCS1 (IWGSC RefSeq v2.0)”这一示例数据，即由 MCGB-B2DSC 生成的 Oliogo-CCS1 在 IWGSC RefSeq v2.0 参考基因组中的分布数据。

4. “作图基本参数”选项卡。

可以调整“作图基本参数”，改变绘图结果。其中：

1. 整张图“总宽度”如果容不下预备绘制图像，将更新为最小能容下的宽度。
2. 整张图“内边距”是为标尺、染色体名称、连接线等预留空间。
3. 染色体“末端圆弧半径”调整后可以将染色体端部绘制成圆弧状。
4. 如果填入了负数，将在“错误和警告信息”模块提示，并将对应输入框标红。

各项参数设置好后，点击“画图”按钮，进行绘图。

如果绘图成功，将显示“保存图片”按钮，同时，“错误和警告信息”将显示绘图所使用的刻度单位。

5. 绘图结果。

图中染色体上的红色横线指示了着丝粒的大致位置。

可以通过修改参数，调整绘图结果。点击“保存图片”，将得到 SVG 格式图片。